原生細胞的合成之經驗分享

　　近年來，合成生物學的研究如火如荼地開展，其目的在于構建人工分子生物系統并執行定制的功能。
 

　　來自湖南大學的研究團隊使用DNA分子反應網絡封裝在原生細胞中，以此構建了一種可以持續處理生物環境中波動生物信息的分子CPU(mCPU)，該研究成果發表于國際期刊Science Advances(IF=14.96)。原生細胞(protocell)的合成是該領域的一大挑戰，下文為此研究團隊中的王老師分享的一些相關經驗。
 

　　1合成原理
 

　　原生細胞的特點是含有微米級大小的空腔和外部的雙層磷脂膜。本論文采用反相微乳液方法制備人工的原生細胞，其特點是幾乎可以封裝任何物質，包括蛋白，核酸和微納顆粒，并可以此定制用戶定義的分子生物系統。
 

　　該方法首先將小體積的水溶液加入到大體積(至少10倍)的磷脂油相中，制成大量油包水的乳液，即單層的微米級腔室。然后將該乳液滴入到含有單層磷脂的水相中，即可獲得雙層磷脂的原生細胞。其中，封裝的物質均溶解在小體積的水溶液中。
 

　　2合成步驟
 

　　準備油相
 

　　首先將儲備溶液(溶解在10 μL CHCl3 中的50 mg/mL 磷脂溶液POPC)completely干燥。然后加入 1 mL 礦物油以溶解脂質膜，如 1.5 mL Eppendorf 管A，通過在 85°C 下孵育直到不再可見未溶解的 POPC。
 

　　準備水相
 

　　將所需的 DNA 鏈溶解在含有 5 mM Mg2+的 280 mM 蔗糖中，作為B管中的內部水相。C管是500μL含有單層磷脂的外部水相，由含有 5 mM Mg2+的DPBS 或280 mM葡萄糖，并在水相頂部加入200 μL POPC溶液。
 

　　制備乳液
 

　　將 20 μL 內溶液移液到 400 μL 油包脂質中，然后在水浴中超聲處理 30 至 60 分鐘以形成油包水乳液。
 

　　制備原生細胞
 

　　將乳液在室溫下平衡 2 分鐘并覆蓋在管 C 的界面溶液上，然后在離心機中靜態孵育 5 分鐘。通過以 5000g 離心 5 分鐘，獲得底部的原生細胞，并在 4 °C 下儲存。
 

　　3注意事項
 

　　重點難點1
 

　　高濃度的磷脂溶液需要completely干燥，最好在小容量的玻璃瓶中旋蒸，使之鋪成一層的白色薄膜。否則后期很難thorough溶解，會形成大量團絮狀的油相雜質。為此，后續的礦物油溶解和乳液形成過程中必要時可以超聲。
 

　　重點難點2
 

　　從乳液到原生細胞的過程中，很多人無法通過離心獲得沉淀產物。因為內部水相和外部水相沒有形成密度差，本文采用的是280 mM蔗糖溶液作為外部水相，280 mM 葡萄糖溶液或DPBS作為內部水相。值得一提的是，在兩者形成密度差的同時，需要保持滲透壓相同以防止原生細胞破裂。
 

　　經過本文實驗，280 mM蔗糖溶液與DPBS滲透壓相同，均等同于生理條件下的滲透壓285-305 mOsm/kg，因此該原生細胞可以在生理條件下與自然細胞相互作用。
 

　　管B的乳液加入到管C的外部水相中需要一段時間的靜態平衡，使得單層磷脂的乳液充分接觸單層油水界面。
 

　　以上為王老師原生細胞合成的經驗分享，希望對大家有所幫助。同時也歡迎更多老師參與文獻獎勵活動，分享您的科研干貨和心得體會！