探針法熒光定量PCR試劑盒制備工藝流程

更新時間：2024-09-06　點擊量：1989

　　探針法熒光定量PCR試劑盒制備工藝流程主要包括核酸提取、反轉錄、探針設計合成、反應體系配制以及熒光定量PCR檢測等步驟。具體流程如下：

　　1.核酸提取

　　樣本準備：采集目標樣本，如組織、血液或細胞。

　　RNA 提取：使用QIAGEN RNeasy Mini Kit或其他類似試劑盒，按照說明書進行RNA提取，確保RNA的純度和完整性。

　　DNA 提取：若需從樣本中提取DNA，采用相應的基因組DNA純化試劑盒進行操作。

　　2.反轉錄

　　cDNA 合成：將提取的RNA反轉錄成cDNA，通常使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，此試劑盒包含去除基因組DNA的gDNA Eraser和反轉錄酶。

　　DNase I處理：在反轉錄前對Total RNA樣品進行DNase I處理，以除去殘存的基因組DNA，避免對后續實驗造成干擾。

　　3.探針設計合成

　　探針設計：根據目標基因序列設計特異性探針，一般選擇與目標序列匹配的寡核苷酸探針，并在5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。

　　探針合成：利用自動化核酸合成儀器進行探針的化學合成，并純化得到的探針以確保其質量。

　　混合試劑：將PCR酶、dNTPs、緩沖液、Mg??、引物、探針和模板cDNA按比例混合，形成完整的PCR反應體系。

　　分裝反應液：將混合好的反應液分裝到PCR管或多孔板中，每個反應單元體積一致，確保實驗結果的準確性和重復性。

　　5.熒光定量PCR檢測

　　PCR 擴增：在實時熒光定量PCR儀器中進行擴增，通過設定特定的循環參數（變性、退火、延伸）來控制PCR過程。

　　熒光數據采集：儀器在每個循環后自動采集熒光數據，實時監測熒光信號的變化，并根據Ct值計算初始模板量。

　　數據分析輸出：軟件自動生成擴增曲線和熔解曲線，并進行數據分析，輸出檢測結果。