人ELISA試劑盒如何實現蛋白、抗體的超靈敏定量？

更新時間：2025-07-08　點擊量：80

　　人ELISA試劑盒通過優化試劑、信號放大和檢測技術，實現蛋白或抗體的超靈敏定量（通常達pg/mL至ng/mL級別）。

　　一、人ELISA試劑盒通超靈敏度的核心機制：

　　1. 高親和力抗體對

　　捕獲抗體與檢測抗體的優化：

　　選擇針對目標蛋白不同表位的高特異性單克隆抗體（如重組單抗或親和層析純化的抗體），減少非特異性結合。

　　通過抗體配對篩選（如棋盤滴定法），確保捕獲抗體與檢測抗體的組合信號輸出。

　　抗體濃度與包被條件：

　　優化捕獲抗體的包被濃度和時間，確保抗原結合位點充足。

　　使用高吸附能力的載體，提升抗原捕獲效率。

　　2. 酶催化信號放大

　　辣根過氧化物酶（HRP）底物系統：

　　采用高靈敏度底物（如TMB、ABTS），HRP催化反應產生有色產物（如TMB氧化后顯藍色），可檢測低至10^-18 mol的酶活性。

　　通過延長顯色時間（如30分鐘）或提高反應溫度（如37℃），增強信號強度。

　　化學發光（ECL）或電化學發光（ECL）：

　　使用魯米諾類底物，在HRP催化下發出光子，通過化學發光儀檢測，靈敏度可達10^-20~10^-24 mol。

　　電化學發光（如聯吡啶釕標記）通過電極激發，背景噪音更低，適合超微量檢測。

　　3. 信號擴增技術

　　生物*-鏈霉親和素系統（BA系統）：

　　檢測抗體標記生物*，通過鏈霉親和素-HRP復合物間接結合，實現信號級聯放大（如每一步結合可放大2~10倍信號）。

　　納米材料應用：

　　使用磁性納米顆粒（如Fe3O4）作為固相載體，增加抗原吸附面積。

　　金納米顆粒或量子點標記抗體，通過多信號輸出（如熒光+比色）提升靈敏度。

　　4. 樣本處理與濃縮

　　血清/血漿預處理：

　　通過離心、過濾或免疫沉淀（IP）去除高豐度蛋白，降低基質干擾。

　　使用蛋白A/G磁珠去除樣本中的非目標抗體，避免競爭性抑制。

　　超濾濃縮：

　　對低濃度樣本（如細胞培養上清）進行超濾離心，濃縮目標蛋白10~100倍。

　　二、人ELISA試劑盒通實驗操作優化：

　　1. 標準曲線設計

　　梯度稀釋：設置至少6個濃度梯度，涵蓋預期樣本濃度范圍。

　　低濃度擴展：在極低濃度區增加多點，擬合非線性曲線。

　　2. 孵育條件優化

　　延長抗原-抗體反應時間：捕獲抗體與抗原的孵育時間從1小時延長至2~3小時，確保低濃度抗原充分結合。

　　封閉液選擇：使用含BSA、酪蛋白或Tween-20的封閉液，封閉板內非特異性結合位點，降低背景噪音。

　　3. 信號讀取與數據分析

　　酶標儀參數設置：

　　比色法：選擇雙波長檢測。

　　化學發光：積分時間設為1~10秒，避免信號飽和。

　　數據擬合：

　　使用四參數邏輯擬合（4PL）替代線性回歸，準確計算低濃度樣本值。

　　設置閾值，排除背景干擾。