人白介素12(IL-12)化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒操作說明

#: 一周內(nèi)使用可存于 4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃。 
相關(guān)試劑在分裝時會比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些，請?jiān)谑褂脮r量取而非直接倒出！ 
 
檢測原理: 
本試劑盒采用雙抗體夾心法。用抗人IL-12抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-12
會與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入*化的抗人IL-12抗體和辣根過氧化物酶
標(biāo)記的親和素。抗人IL-12抗體與結(jié)合在包被抗體上的人IL-12結(jié)合、*與親和素特異性結(jié)合
而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入發(fā)光底物混合液，發(fā)光底物在辣根過氧化物酶的催
化下發(fā)出熒光，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定化學(xué)發(fā)光值（RLU），IL-12濃度與化學(xué)發(fā)光值之間呈
正相關(guān)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-12的濃度。 
樣品收集: 
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃一夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。 
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA.Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。 
3. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。 
4. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，以去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞
會影響測量結(jié)果），稱重后將*碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量
體積比，比如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記
錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂
解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分
鐘，取上清檢測。 
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測 
6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 
7. 樣品收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃/-80℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，
1-6月內(nèi)檢測，4℃保存的應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測。 
8. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先
做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。 
 
試驗(yàn)所需自備物品: 
1. 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 
4. 吸水紙 
 
檢測前準(zhǔn)備工作: 
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用。 
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，輕輕混勻（濃度為800pg/mL）。然后根據(jù)
需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：800、
400、200、100、50、25、12.5、0pg/mL，樣品稀釋液直接作為空白孔0pg/mL。如配制400pg/mL
標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL 800pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中，混
勻即可，其余濃度依此類推。 
4. *化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時應(yīng)多配
制100-200μL。使用前15分鐘，以*化抗體稀釋液稀釋濃縮*化抗體(1:100)成工作 
濃度。當(dāng)日使用。 
5. 酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當(dāng)日使用。 
6. 發(fā)光底物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘，將發(fā)光底物A液和B液等體積混合。當(dāng)日使用。 
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋，如200μL/管） 
 
800 400 200 100 50 25 12.5 0 pg/mL 
 
洗滌方法: 
1. 自動洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。 
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。 
 
操作步驟: 
實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。 
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 100μL，余孔分
別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次
實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 
2. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入*化抗體工作液 100μL（在使用前 15
分鐘內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。 
3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。 
4. 每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前 15 分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。 
5. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。 
6. 每孔加發(fā)光底物工作液 100μL，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 5 分鐘左右。 
7. 立即用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定各孔的化學(xué)發(fā)光值。應(yīng)提前打開化學(xué)發(fā)光免疫分析儀電源，
預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。 
8. 實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束。 
注意事項(xiàng)： 
1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。 
2. 酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成
任何影響。 
3. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的
“預(yù)溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時間控制在
10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。 
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)
板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。 
5. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸
水。 
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，
運(yùn)輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用*0轉(zhuǎn)/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的
液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、*化抗體工
作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請
配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時，
一次不要小于10μL），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)
準(zhǔn)品、*化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分
裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。 
7. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。 
8. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量
振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。 
9. 安全：試驗(yàn)中請穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時，請按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。 
10. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外） 
11. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果！ 
 
結(jié)果判斷: 
1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)發(fā)光值（RLU）減去空白孔的化學(xué)發(fā)光值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其
平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，化學(xué)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以化學(xué)
發(fā)光值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如 curve expert 1.3 或 1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品化學(xué)發(fā)
光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的化學(xué)發(fā)光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線
的擬合方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 
3. 若標(biāo)本化學(xué)發(fā)光值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。 
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復(fù)性: 
●靈敏度：zui小可測 7.5pg/mL。 
●檢測范圍：12.5–800pg/mL。 
● 特異性：可檢測重組或天然的人 IL-12，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 
● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<15%。 
操作概要 
1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各 100μL，37℃孵育 90 分鐘 
2. 倒去孔內(nèi)液體，加入 100μL *化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘 
3. 洗滌 3 次 
4. 加入 100μL 酶結(jié)合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘 
5. 洗滌 5 次 
6. 加入 100μL 發(fā)光底物工作液， 37℃孵育 5 分鐘左右 
7. 立即測定各孔的化學(xué)發(fā)光值 
8. 結(jié)果計(jì)算