原代細(xì)胞分離技術(shù)

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 懸浮細(xì)胞的分離方法

   1) 將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

   2) 去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復(fù)兩次。

   3) 用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)。

   4) 如選用懸液中某種細(xì)胞，可采用離心后的細(xì)胞分層液收獲目的細(xì)胞。

2. 實(shí)體組織材料的分離方法

   1）機(jī)械分散法
      a. 纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm³的組織塊。
      b. 用PBS清洗兩次后
      ①用吸管吹打，分散組織細(xì)胞。
      ②或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭壓出。
      ③或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物（注射器鈍端）壓擠使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。
      c. 收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。
      d. 去上清，加入含血清的培養(yǎng)基，重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

   2）消化分離法

酶消化分離法（過夜冷消化法）
      a. 細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。
      b. 再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。
      c. 加入0.25%的*，搖勻后放4℃過夜。
      d. 次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。
      e. 加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

非酶消化法（EDTA消化法）
      a. 把組織塊剪碎，呈1mm³大小的組織塊。
      b. 將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂PBS洗2-3次。
      c. 加入消化液（*或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。
      d. 棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，并洗滌2-3次后，加入*培養(yǎng)基。
      e. 用吸管吹打，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)過濾后分瓶培養(yǎng)。