基因組DNA的提取

基因組DNA的提取

DNA是遺傳信息的載體,是zui重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象,因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的zui重要、zui基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。 
 
在DNA提取過(guò)程中應(yīng)做到1,根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2,盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3,保證提取樣品中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。下面結(jié)合不同的研究對(duì)象列出幾種相應(yīng)的DNA提取方法。  
 
    方法1，總DNA的大量提取 
 
    本方法通過(guò)液氮研磨粉碎動(dòng)植物組織、裂解液裂解細(xì)胞、有機(jī)溶劑抽提，使進(jìn)入水相的核酸與蛋白成分分開(kāi)，在RNA酶作用下，降解RNA，得純度較高的DNA樣品。 
 
    一：儀器  高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴、低溫冰箱或冰柜、冷凍真空干燥器、取液器、電泳儀、水平電泳槽、紫外觀測(cè)儀 
 
    二：試劑 細(xì)胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；飽和酚；/異戊醇；異丙醇；70%及無(wú)水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE緩沖液；載樣緩沖液 
 
    三:操作 動(dòng)植物材料10g(鮮組織) 0.5g(干凍組織) 
                            液氮,研碎 
10ml裂解液(含1/10體積酚),(65℃預(yù)熱),  
                            加入等體積, 65℃放置30分鐘， 
間隔5－10min輕搖一次,  
離心(12000-15000rpm, 15min ) 
                   上清液 
靜止下 
0.6體積冷異丙醇, 
0.1體積3MpH5,2乙酸鈉,  
                 挑取絮狀體, 70%冷乙醇洗滌,真空干燥, 
        2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃,10-30分復(fù)溶和除RNA 
                         
等體積酚/抽提 
（輕輕混勻、冰浴沉淀5min，5000RPM離心5min，取上清） 
上清液 
2V無(wú)水乙醇、1/10VnaAC, 
-20,2或-80℃，30min 
                                 10000RPM,10min 
 
沉 淀  
70%冷乙醇洗滌 
真空干燥 
干粉-20℃保存， 
或復(fù)溶于0.5-1mlTE或水中,分裝成小體積, -20℃或4℃保存 
 
四：鑒定  
所提DNA進(jìn)行Agarose膠分析（電泳過(guò)程見(jiàn)附），紫外觀測(cè)儀觀測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝。 
 
注意: 
1,裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶解 
2，酚一定要堿平衡 
      3,各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解 
      4,取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類(lèi)成分干擾. 
      5,異丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進(jìn)DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。 
      6,本方法適用于以DNA片段的酶切分析、Southern印跡等中，具有快速、省時(shí)、省線的特點(diǎn)。 
      7,此方法也適合菌類(lèi)DNA的大量提取。